A ligação entre luz, eletricidade e magnetismo foi sendo concebida ao longo do tempo através de sucessivas descobertas.

O astrônomo William Herschel, investigando a relação entre luz e calor utilizando um termômetro e um prisma, descobriu que a temperatura era maior em uma região além da região do vermelho no espectro de cores da luz visível. Herschel sugeriu que deveria haver "algum tipo de luz" que não era perceptível ao olho humano.

O termo, radiação eletromagnética, proposto por James Clerk Maxwell, designa as características elétricas e magnéticas características a todas as formas de enegia ondulatória da qual a luz visível representa apenas uma pequena fração.

Figura 82. Espectro Eletromagnético.

A medida padrão para o comprimento de onda (λ) costuma ser feita em nanômetro (10^-9 m) e definida como a distância entre dois picos (ou vales) sucessivos.

A frequência (f) corresponde ao número de ciclos (comprimentos de onda) que passam por um dado ponto por segundo e expressa comumente em Hz ou cps (ciclos por segundo).

Figura 83. Onda Eletromagnética.

Essas grandezas estão relacionadas entre si e com a velocidade da luz (c) pela seguinte relação: c = λ x f

A cor é relacionada com os diferentes comprimento de onda do espectro eletromagnético. (Fonte: Wikipedia)

Figura 84. Comprimento de onda e as cores.

Quando uma radiação eletromagnética atravessa uma camada de um sólido, líquido ou gás, algumas frequências são seletivamente removidas pela absorção, um processo no qual a energia eletromagnética é transferida para átomos, íons ou moléculas que compõem a amostra.

A absorção promove essas “entidades” (átomos, íons ou moléculas) do seu estado normal à temperatura ambiente, ou estado fundamental, para um ou mais estados excitados de maior energia.

De acordo com a teoria quântica, átomos, íons ou moléculas têm somente um número limitado de níveis de energia discretos e para que a absorção da radiação ocorra, a energia do fóton de excitação deve ser exatamente igual à diferença de energia entre o estado fundamental e um estado excitado da amostra absorvedora.

Uma vez que essa diferença de energia é única para cada espécie, um estudo das frequências da radiação absorvida fornece um meio de identificar os constituintes de uma amostra de matéria. Para isso determina-se experimentalmente um gráfico da absorbância ^[5] em função do comprimento de onda, ou da frequência.

Figura 85. Espectros de absorção para pigmentos vegetais (Clorofila A, Clorofila B e Carotenóides). (Fonte: www.plantingscience.org

Os espectros de absorção variam muito na aparência: alguns são constituídos por numerosos picos estreitos, enquanto outros consistem de curvas contínuas e largas. Essas diferenças se devem a diversos fatores, tais como a complexidade, estado físico e vizinhança da espécie absorvedora.

A passagem de radiação visível ou ultravioleta policromática através de um meio contendo partículas monoatômicas, como o mercúrio ou sódio gasosos, provoca a absorção de algumas frequências bem-definidas. Por exemplo, o vapor de sódio exibe dois picos de absorção estreitos e próximos na região do amarelo do espectro visível (589,0 e 589,6 nm), que são o resultado da excitação do elétron 3s para dois estados 3p que diferem ligeiramente em energia, além de várias outras linhas estreitas de absorção, que correspondem a outras transições eletrônicas permitidas.

Figura 86. Picos de absorção do vapor de sódio em 589,0 e 589,6 nm.(Fonte: Skoog, 2002, página 132)

As radiações visível e ultravioleta têm energia suficiente para provocar transições somente dos elétrons da camada mais externa, ou dos elétrons de ligação. Por outro lado, as frequências dos Raios X são muito mais energéticas e portanto são capazes de interagir com os elétrons mais próximos do núcleo dos átomos.

É a absorção seletiva de luz visível que determina a cor exibida pela maior parte das substâncias. Quando uma amostra de matéria absorve praticamente toda a gama de radiações visíveis, não transmitindo nem refletindo luz, então ela apresenta-se-nos preta. Se, pelo contrário, praticamente nada absorve de luz visível, tudo transmitindo ou refletindo da luz incidente, então trata-se de uma substância incolor (se essencialmente transmite luz recebida) ou branca (se essencialmente a reflete). Entre estes dois casos extremos situam-se as substâncias ou materiais coloridos. A percepção de cor é o resultado da absorção seletiva de diferentes comprimentos de onda. (Fonte: http://www.angelfire.com/ab/prvs/absor.html

Figura 87. Conjunto dos comprimentos de onda correspondentes ao espectro de emissão de uma lâmpada de tungstênio-halogênio (luz branca)(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Figura 88. Região espectral transmitida por uma solução aquosa de azul de bromotimol 10^-5molar (laranja!) e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Figura 89. Região espectral transmitida por uma solução de solução etanólica (amarela) de fluoresceína 10^-5 molar e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

A figura abaixo mostra um feixe de radiação monocromática de Potência P₀ incidindo sobre uma solução, o qual, após os processos internos de absorção sai da solução com uma potência radiante P.

Figura 90. Diagrama da absorção de um feixe de luz "monocromática" atravessando uma cubeta de tamanho b.(Fonte: Wikipedia)

A quantidade de radiação absorvida pode ser calculada de diferentes maneiras, Transmitância ou Absorbância:

Transmitância, T = P/P₀

T(%) = 100 x T

Absorbância, A = log₁₀ P₀/P

A = log₁₀ 1/T

Figura 91. Para uma solução com transmitância de 100% a Absorbância é zero e se toda a luz for absorvida a transmitância é 0 e a absorbância é infinita!

A lei de Lambert-Beer pode ser expressa pela equação:

A = ebc

Porque, (até um limite de concentração) existe uma relação linear entre a absorbância e a concentração da substância absorvente. Portanto, mantendo-se o caminho óptico constante, pode-se determinar a concentração de uma espécie em solução, através da medida de absorbância.

Figura 92. Gráficos da relação de Transmitância e Absorbância para diferentes concentrações de permanganato de potássio.

Na prática, um gráfico de calibração (absorbância versus concentração), da espécie de interesse é construída com o uso de soluções padrão (de concentração conhecida) e a concentração da amostra que se quer analisar é determinada pela interpolação da leitura de absorbância no gráfico de calibração.

No entanto a relação não é linear para altas concentrações. Por isso é importante definir a faixa de concentração adequada para medidas quantitativas, na qual a relação entre absorbância e concentração é linear.

Figura 93. Desvio da Lei de Beer em altas concentrações

Qual o significado de "e" na equação A = ebc ?

Rearranjando:

e = A / bc

"e" é a absortividade molar e pode ser definida como a quantidade de luz que é absorvida por unidade de concentração.

É constante para uma determinada substância.

Para se ter uma idéia, a absortividade molar dos íons Cu⁺² em solução de sulfato de cobre (CuSO₄) é 20 L mol^-1 cm^-1 enquanto o β-caroteno, responsável pela cor das cenouras, possui uma absortividade molar de 100.000 L mol^-1 cm^-1.

Fiz uma introdução muito sucinta da espectrofotometria de absorção molecular. Agora vamos fazer um breve resumo da instrumentação usada.

A concepção física de um espectrofotômetro para absorção é diferente de um espectrofotômetro para luminescência, o qual é denominado espectrofluorímetro. Além disso estaremos nos referindo a equipamentos operando na região espectral do visível (Vis) (380-400 nm < λ < 700-800 nm) e do ultravioleta (UV) (200 < λ < 380-400 nm).

Não vamos abordar os equipamentos que operam na região do infravermelho próximo (do inglês, near infrared - NIR) (800 nm < λ < 3300 nm).

Espectrofotômetros de absorção, em geral, são instrumentos compostos por:

As fontes de radiação podem ser lâmpadas de filamento ou LEDs que emitem radiação na região do espectro que se pretende utilizar.

Características ideais:

O espectrofotômetros têm, normalmente, dois tipos de fontes:

Figura 94. Espectro emissão de uma lâmpada de deutério.

Figura 95. Espectro emissão de uma lâmpada de tungstênio.

Com respeito às lâmpadas é importante lembrar que com o tempo de uso das lâmpadas aumentam as variações na intensidade da luz introduzindo ruídos (erros) nas determinações os quais podem ser monitorados com a adoção de procedimentos de controle de qualidade. (A ser discutido em outro documento!)

Dependendo dos tipos de componentes ópticos, os espectrofotômetros são classificados em: dispersivos, com prismas ou grades e os interferométricos.

Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como por exemplo prismas e grades de difração.

Elementos interferométricos utilizam processos de interferência da radiação eletromagnética, como por exemplo o interferômetro de Michelson, que é utilizado nos espectrofotômetros operando na região do infravermelho com o uso da transformada de Fourier do sinal.

A finalidade destes componentes é difratar a luz de modo que diferentes comprimentos de onda irão incidir sobre a amostra permitindo que se determine sua absorbância para os diferentes comprimentos de onda.

Uma grade de difração contém uma série de ranhuras, responsáveis pela difração. Quanto maior o número de ranhuras por milímetro melhor a resolução dos espectros.

Figura 96. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Figura 97. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Considerando-se apenas os sistemas que usam grade de difração, podemos dividir os espectrofotômetros em duas classes: os que utilizam como sistema de detecção um tubo fotomultiplicador e os que utilizam arranjo de diodos.

15.2.4.1. Fotomultiplicadora

Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro ou de quartzo sob vácuo, no qual existe um conjunto de placas metálicas interligadas.

Figura 98. Ao lado, um esquema e uma fotografia do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU - R928, utilizado no espectrofotômetro Cary 2300 - Varian.

Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas induzem uma corrente elétrica, devido ao efeito fotoelétrico proposto por Einstein. Esta "fotocorrente" é amplificada por um circuito eletrônico e registrado.

As fotomultiplicadoras, apresentam sensibilidades que dependem da faixa espectral da radiação incidente.

Com o uso deste tipo de detector, o sistema óptico deve selecionar cada comprimento de onda, sequencialmente, que deve incidir sobre a fotomultiplicadora gerando, segundo uma certa escala, um sinal de absorbância.

Atenção

É importante lembrar que ao abrir o compartimento de um espectrofotômetro, a fotomultiplicadora deve ser protegida da luz para que não seja queimada.

15.2.4.2. Arranjo de Diodos

O segundo tipo de detector é arranjo de diodos ou detectores do tipo fotodiodo, PDA (photodiode array).

De modo simplificado, um arranjo de diodos consiste em uma série de fotodiodos posicionado lado a lado em um cristal de silício, de modo que cada comprimento de onda difratado pela grade atinge um ponto deste arranjo, e consequentemente um detector. Deste modo, a absorbância em todos os comprimentos de onda é determinada de modo simultâneo.

Figura 99. Visão lateral de um fotodiodo. (Fonte: http://parts.digikey.com)

15.2.4.3. CCD

Além dos arranjos de diodos existem os detectores CCD (charge-coupled device), os quais também permitem detecção simultânea de todo o espectro de absorção. Assim como no arranjo de diodos a luz dispersada pela grade atravessa a amostra e os diferentes comprimentos de onda atingem os diferentes pixels do detector.

A resolução depende da grade, do projeto do espectrofotômetro e do tamanho de cada pixel do detector. Esses instrumentos costuman ser relativamente pequenos permitindo separar o sistema óptico do compartimento de amostra com o uso de fibras ópticas que transmitem a luz para/da amostra.

Figura 100. Exemplo de um espectrofotômetro com detector CCD da Ocean Optics (USB2000) com dimensões de 8.9 cm x 6.3 cm x 3.4 cm e pesando 190 g (Fonte: www.oceanoptics.com)

Todo espectrofotômetro deve possuir um compartimento para acomodar a cubeta ou cela de leitura.

Os compartimentos podem dispor de recursos para termostatização da cubeta permitindo realizar medidas de absorção em diferentes temperaturas.

Figura 103. Compartimento para cubeta do espectrofotômetro Femto 600S

Figura 104. Existem cubetas com diferentes geometrias para diferentes finalidades.

Para os métodos de análise em fluxo são usadas celas de fluxo nas quais a amostra circula continuamente através da cela com leitura simultânea da Absorbância ou Transmitância.

Figura 105. Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho óptico.(Fonte: www.starna.com)

Figura 106. Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico, 30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)

Com o uso de fibras ópticas é possível manter o compartimento de leitura com a cela de fluxo separada do conjunto do espectrofotômetro oferecendo maior versatilidade para o sistema de análise.

Figura 107. Cela de fluxo em Z, com janela de sílica fundida.(Fonte: www.flowinjection.com)