J.2. Instrumentos para Espectrofotometria

J.2.1. Espectrofotômetros de Absorção

A concepção física de um espectrofotômetro para absorção é diferente de um espectrofotômetro para luminescência, o qual é denominado espectrofluorímetro. Além disso estaremos nos referindo a equipamentos operando na região espectral do visível (Vis) (380-400 nm < λ < 700-800 nm) e do ultravioleta (UV) (200 < λ < 380-400 nm).

Não vamos abordar os equipamentos que operam na região do infravermelho próximo (do inglês, near infrared - NIR) (800 nm < λ < 3300 nm).

Espectrofotômetros de absorção, em geral, são instrumentos compostos por:

  • fonte de radiação eletromagnética (luz),

  • sistema óptico que leva a radiação até a amostra,

  • compartimento de amostra,

  • detectores que medem a intensidade de radiação.

J.2.2. Fontes de Radiação

As fontes de radiação podem ser lâmpadas de filamento ou LEDs que emitem radiação na região do espectro que se pretende utilizar.

Características ideais:

  • intensidade constante ao longo da faixa de trabalho

  • pouco ruído (pouca oscilação na intensidade)

  • longa durabilidade

O espectrofotômetros têm, normalmente, dois tipos de fontes:

  • lâmpadas de deutério (tempo de vida: 1.000 h), para excitação na região do ultravioleta (< 350 nm)

  • lâmpadas de tungstênio ou tungstênio-halogênio (>350 nm; tempo de vida 10.000 h) para excitação na região do visível e infravermelho próximo.

  • Diodo Emissor de Luz LED

Figura J.13. Espectro emissão de uma lâmpada de deutério.

Espectro emissão de uma lâmpada de deutério.


Figura J.14. Espectro emissão de uma lâmpada de tungstênio.

Espectro emissão de uma lâmpada de tungstênio.


Com respeito às lâmpadas é importante lembrar que com o tempo de uso das lâmpadas aumentam as variações na intensidade da luz introduzindo ruídos (erros) nas determinações os quais podem ser monitorados com a adoção de procedimentos de controle de qualidade. (A ser discutido em outro documento!)

Atenção

Uma outra questão prática é o fato de que a maioria dos procedimentos analíticos para águas e efluentes utiliza a região visível do espectro. No entanto é muito comum a compra de espectrofotômetros UV-Vis, mais caros, e cubetas de quartzo, mas que serão utilizados apenas para leituras na região do Visível (380-400 < λ < 700-800 nm)!

J.2.3. Sistema Óptico

Dependendo dos tipos de componentes ópticos, os espectrofotômetros são classificados em: dispersivos, com prismas ou grades e os interferométricos.

Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como por exemplo prismas e grades de difração.

Elementos interferométricos utilizam processos de interferência da radiação eletromagnética, como por exemplo o interferômetro de Michelson, que é utilizado nos espectrofotômetros operando na região do infravermelho com o uso da transformada de Fourier do sinal.

A finalidade destes componentes é difratar a luz de modo que diferentes comprimentos de onda irão incidir sobre a amostra permitindo que se determine sua absorbância para os diferentes comprimentos de onda.

Uma grade de difração contém uma série de ranhuras, responsáveis pela difração. Quanto maior o número de ranhuras por milímetro melhor a resolução dos espectros.

Figura J.15. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)


Figura J.16. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)

Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)


J.2.4. Detectores - Transdutores de Radiação

Nos primeiros instrumentos de Fotometria, os detectores eram o olho humano ou uma placa ou filme fotográfico. Mas com o tempo esses meios de detecção foram substituídos por transdutores que convertem energia radiante em sinais elétricos. (Fonte: Skoog, 2002)

Um transdutor ideal deveria apresentar uma alta sensibilidade, alta relação sinal-ruído e uma resposta constante sobre um amplo intervalo de comprimentos de onda. Além disso, deveria apresentar um tempo de resposta rápido e sinal de saída igual a zero na ausência de iluminação.

E finalmente, o sinal elétrico produzido pelo transdutor deveria ser diretamente proporcional à potência radiante P. Isto é,:

S = kP

Onde S é a resposta elétrica em termos de corrente ou tensão e k é a calibração da sensibilidade.

Conforme a figura seguinte, existem dois tipos gerais de transdutores de radiação: detectores de fótons e detectores térmicos.

Figura J.17. Tipos de detectores de radiação.(Fonte: Skoog, 2002)

Tipos de detectores de radiação.(Fonte: Skoog, 2002)

Considerando-se apenas os sistemas que usam grade de difração, podemos dividir os espectrofotômetros em duas classes: os que utilizam como sistema de detecção um tubo fotomultiplicador e os que utilizam arranjo de diodos.

J.2.4.1. Tubo fotomultiplicador

Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro ou de quartzo sob vácuo, no qual existe um conjunto de placas metálicas interligadas.

Figura J.18. Ao lado, um esquema e uma fotografia do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU - R928, utilizado no espectrofotômetro Cary 2300 - Varian.

Ao lado, um esquema e uma fotografia do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU - R928, utilizado no espectrofotômetro Cary 2300 - Varian.


Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas induzem uma corrente elétrica, devido ao efeito fotoelétrico proposto por Einstein. Esta "fotocorrente" é amplificada por um circuito eletrônico e registrado.

As fotomultiplicadoras, apresentam sensibilidades que dependem da faixa espectral da radiação incidente.

Com o uso deste tipo de detector, o sistema óptico deve selecionar cada comprimento de onda, sequencialmente, que deve incidir sobre a fotomultiplicadora gerando, segundo uma certa escala, um sinal de absorbância.

Atenção

É importante lembrar que ao abrir o compartimento de um espectrofotômetro, a fotomultiplicadora deve ser protegida da luz para que não seja queimada.

J.2.4.2. Arranjo de Diodos

O segundo tipo de detector é arranjo de diodos ou detectores do tipo fotodiodo, PDA (photodiode array).

De modo simplificado, um arranjo de diodos consiste em uma série de fotodiodos posicionado lado a lado em um cristal de silício, de modo que cada comprimento de onda difratado pela grade atinge um ponto deste arranjo, e consequentemente um detector. Deste modo, a absorbância em todos os comprimentos de onda é determinada de modo simultâneo.

Figura J.19. Visão lateral de um fotodiodo. (Fonte: http://parts.digikey.com)

Visão lateral de um fotodiodo. (Fonte: http://parts.digikey.com)


J.2.4.3. CCD

Além dos arranjos de diodos existem os detectores CCD (charge-coupled device), os quais também permitem detecção simultânea de todo o espectro de absorção. Assim como no arranjo de diodos a luz dispersada pela grade atravessa a amostra e os diferentes comprimentos de onda atingem os diferentes pixels do detector.

A resolução depende da grade, do projeto do espectrofotômetro e do tamanho de cada pixel do detector. Esses instrumentos costuman ser relativamente pequenos permitindo separar o sistema óptico do compartimento de amostra com o uso de fibras ópticas que transmitem a luz para/da amostra.

Figura J.20. Exemplo de um espectrofotômetro com detector CCD da Ocean Optics (USB2000) com dimensões de 8.9 cm x 6.3 cm x 3.4 cm e pesando 190 g (Fonte: www.oceanoptics.com)

Exemplo de um espectrofotômetro com detector CCD da Ocean Optics (USB2000) com dimensões de 8.9 cm x 6.3 cm x 3.4 cm e pesando 190 g (Fonte: www.oceanoptics.com)


J.2.5. Configuração

J.2.5.1. Espectrofotômetro de Feixe Simples

O procedimento experimental convencional de obtenção de espectros de absorção em um instrumento deste tipo envolve inicialmente o registro de um espectro do ruído de fundo (background) ou do solvente ou do ar (a serem utilizados como branco). Arquiva-se o mesmo e, em sequência, se obtém o espectro da amostra e se efetua a subtração dos dois. O resultado deve ser o espectro da amostra tendo-se o solvente (ou ar) como branco.

Figura J.21. Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Feixe Simples

Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Feixe Simples


O procedimento de calibração consiste em ajustar o nível de 100% de transmitância (zero de absorbância) do equipamento com uma cubeta contendo todos os componentes da solução a ser medida, menos a substância de interesse ("branco"), e o nível 0% de transmitância com o obturador do aparelho fechado.

As leituras das amostras serão feitas em relação ao branco, substituindo-o pelas amostras.

J.2.5.2. Espectrofotômetro de Duplo Feixe

Na configuração de duplo feixe é necessário um componente denominado obturador eletromecânico (chopper), que tem a finalidade de alternar a passagem da luz pela cela de amostra e referências.

Os sinais elétricos gerados pelos detectores são amplificados e "comparados" pelo sistema eletrônico gerando um espectro de absorbância ou transmitância da amostra "subtraído" do espectro da referência.

Figura J.22. Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Duplo Feixe

Diagrama esquemático de um espectrofotômetro de Duplo Feixe


Para equipamentos de duplo feixe, a radiação proveniente do monocromador é igualmente dividida em dois feixes, que incidem em dois compartimentos, o de referência e o da amostra. O ajuste inicial é feito colocando-se o "branco" nos dois compartimentos e regulando-se o aparelho para absorbância zero, e as leituras são feitas substituindo-se o "branco" do compartimento da amostra pelas amostras a serem medidas. O usuário deverá ler atentamente o manual do seu equipamento para se informar sobre os demais detalhes operacionais.

J.2.6. Cubetas

Todo espectrofotômetro deve possuir um compartimento para acomodar a cubeta ou cela de leitura.

Os compartimentos podem dispor de recursos para termostatização da cubeta permitindo realizar medidas de absorção em diferentes temperaturas.

Figura J.23. Compartimento para cubeta do espectrofotômetro Femto 600S

Compartimento para cubeta do espectrofotômetro Femto 600S


Figura J.24. Existem cubetas com diferentes geometrias para diferentes finalidades.

Existem cubetas com diferentes geometrias para diferentes finalidades.


J.2.7. Celas de Fluxo

Para os métodos de análise em fluxo são usadas celas de fluxo nas quais a amostra circula continuamente através da cela com leitura simultânea da Absorbância ou Transmitância.

Figura J.25. Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho óptico.(Fonte: www.starna.com)

Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho óptico.(Fonte: www.starna.com)


Figura J.26. Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico, 30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)

Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico, 30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)


Com o uso de fibras ópticas é possível manter o compartimento de leitura com a cela de fluxo separada do conjunto do espectrofotômetro oferecendo maior versatilidade para o sistema de análise.

Figura J.27. Cela de fluxo em Z, com janela de sílica fundida.(Fonte: www.flowinjection.com)

Cela de fluxo em Z, com janela de sílica fundida.(Fonte: www.flowinjection.com)