A concepção física de um espectrofotômetro para absorção é diferente de um espectrofotômetro para luminescência, o qual é denominado espectrofluorímetro. Além disso estaremos nos referindo a equipamentos operando na região espectral do visível (Vis) (380-400 nm < λ < 700-800 nm) e do ultravioleta (UV) (200 < λ < 380-400 nm).
Não vamos abordar os equipamentos que operam na região do infravermelho próximo (do inglês, near infrared - NIR) (800 nm < λ < 3300 nm).
Espectrofotômetros de absorção, em geral, são instrumentos compostos por:
fonte de radiação eletromagnética (luz),
sistema óptico que leva a radiação até a amostra,
compartimento de amostra,
detectores que medem a intensidade de radiação.
As fontes de radiação podem ser lâmpadas de filamento ou LEDs que emitem radiação na região do espectro que se pretende utilizar.
Características ideais:
intensidade constante ao longo da faixa de trabalho
pouco ruído (pouca oscilação na intensidade)
longa durabilidade
O espectrofotômetros têm, normalmente, dois tipos de fontes:
lâmpadas de deutério (tempo de vida: 1.000 h), para excitação na região do ultravioleta (< 350 nm)
lâmpadas de tungstênio ou tungstênio-halogênio (>350 nm; tempo de vida 10.000 h) para excitação na região do visível e infravermelho próximo.
Diodo Emissor de Luz LED
Com respeito às lâmpadas é importante lembrar que com o tempo de uso das lâmpadas aumentam as variações na intensidade da luz introduzindo ruídos (erros) nas determinações os quais podem ser monitorados com a adoção de procedimentos de controle de qualidade. (A ser discutido em outro documento!)
Atenção
Uma outra questão prática é o fato de que a maioria dos procedimentos analíticos para águas e efluentes utiliza a região visível do espectro. No entanto é muito comum a compra de espectrofotômetros UV-Vis, mais caros, e cubetas de quartzo, mas que serão utilizados apenas para leituras na região do Visível (380-400 < λ < 700-800 nm)!
Dependendo dos tipos de componentes ópticos, os espectrofotômetros são classificados em: dispersivos, com prismas ou grades e os interferométricos.
Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como por exemplo prismas e grades de difração.
Elementos interferométricos utilizam processos de interferência da radiação eletromagnética, como por exemplo o interferômetro de Michelson, que é utilizado nos espectrofotômetros operando na região do infravermelho com o uso da transformada de Fourier do sinal.
A finalidade destes componentes é difratar a luz de modo que diferentes comprimentos de onda irão incidir sobre a amostra permitindo que se determine sua absorbância para os diferentes comprimentos de onda.
Uma grade de difração contém uma série de ranhuras, responsáveis pela difração. Quanto maior o número de ranhuras por milímetro melhor a resolução dos espectros.
Figura J.15. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)
Figura J.16. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)
Nos primeiros instrumentos de Fotometria, os detectores eram o olho humano ou uma placa ou filme fotográfico. Mas com o tempo esses meios de detecção foram substituídos por transdutores que convertem energia radiante em sinais elétricos. (Fonte: Skoog, 2002)
Um transdutor ideal deveria apresentar uma alta sensibilidade, alta relação sinal-ruído e uma resposta constante sobre um amplo intervalo de comprimentos de onda. Além disso, deveria apresentar um tempo de resposta rápido e sinal de saída igual a zero na ausência de iluminação.
E finalmente, o sinal elétrico produzido pelo transdutor deveria ser diretamente proporcional à potência radiante P. Isto é,:
S = kP
Onde S é a resposta elétrica em termos de corrente ou tensão e k é a calibração da sensibilidade.
Conforme a figura seguinte, existem dois tipos gerais de transdutores de radiação: detectores de fótons e detectores térmicos.
Considerando-se apenas os sistemas que usam grade de difração, podemos dividir os espectrofotômetros em duas classes: os que utilizam como sistema de detecção um tubo fotomultiplicador e os que utilizam arranjo de diodos.
Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro ou de quartzo sob vácuo, no qual existe um conjunto de placas metálicas interligadas.
Figura J.18. Ao lado, um esquema e uma fotografia do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU - R928, utilizado no espectrofotômetro Cary 2300 - Varian.
Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas induzem uma corrente elétrica, devido ao efeito fotoelétrico proposto por Einstein. Esta "fotocorrente" é amplificada por um circuito eletrônico e registrado.
As fotomultiplicadoras, apresentam sensibilidades que dependem da faixa espectral da radiação incidente.
Com o uso deste tipo de detector, o sistema óptico deve selecionar cada comprimento de onda, sequencialmente, que deve incidir sobre a fotomultiplicadora gerando, segundo uma certa escala, um sinal de absorbância.
Atenção
É importante lembrar que ao abrir o compartimento de um espectrofotômetro, a fotomultiplicadora deve ser protegida da luz para que não seja queimada.
O segundo tipo de detector é arranjo de diodos ou detectores do tipo fotodiodo, PDA (photodiode array).
De modo simplificado, um arranjo de diodos consiste em uma série de fotodiodos posicionado lado a lado em um cristal de silício, de modo que cada comprimento de onda difratado pela grade atinge um ponto deste arranjo, e consequentemente um detector. Deste modo, a absorbância em todos os comprimentos de onda é determinada de modo simultâneo.
Além dos arranjos de diodos existem os detectores CCD (charge-coupled device), os quais também permitem detecção simultânea de todo o espectro de absorção. Assim como no arranjo de diodos a luz dispersada pela grade atravessa a amostra e os diferentes comprimentos de onda atingem os diferentes pixels do detector.
A resolução depende da grade, do projeto do espectrofotômetro e do tamanho de cada pixel do detector. Esses instrumentos costuman ser relativamente pequenos permitindo separar o sistema óptico do compartimento de amostra com o uso de fibras ópticas que transmitem a luz para/da amostra.
Figura J.20. Exemplo de um espectrofotômetro com detector CCD da Ocean Optics (USB2000) com dimensões de 8.9 cm x 6.3 cm x 3.4 cm e pesando 190 g (Fonte: www.oceanoptics.com)
O que é um LED?
LED (Light Emitting Diode = Diodo Emissor de Luz) é uma fonte de radiação baseada em um efeito electroluminescente que ocorre quando uma corrente elétrica passa por um material inorgânico. O LED pode emitir luz em diferentes comprimentos de onda dependendo da composição do material inorgânico (GeAs, GaSb, GaP, GaAsP, InP, InGaN etc).
Mas o que é um Diodo?
Diodos são componentes que deixam a corrente elétrica passar em apenas uma direção. Existem diversos tipos de diodos com características muito diversas. Os diodos que são usados primordialmente para deixar a corrente passar em apenas uma direção são chamados retificadores como na figura J.22
O desenvolvimento de LEDs com emissão desde o infravermelho até o ultravioleta juntamente com o aumento da intensidade e o baixo custo e baixo consumo de energia tornaram esses componentes alternativas viáveis para substituir as tradicionais lâmpadas de tungstênio e deutério como fontes de emissão para instrumentos fotométricos.
Figura J.23. Espectros de emissão de diferentes LEDs comerciais desde o UV até o Infravermelho próximo. UV: 255 nm, 280 nm, 365 nm. Visível: azul 464 nm, verde 516 nm, âmbar (laranja amarelado) 590 nm, vermelho 635 nm, vermelho escuro 645 nm. Infravermelho: 850 nm. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
Além disso apresentam uma banda de emissão estreita de aproximadamente 20nm de largura o que dispensa o uso de monocromadores como mostra a figura J.24.
Figura J.24. Espectros de emissão de diferentes LEDs comerciais na região do visível (Fonte: Martina O'Toole, 2007)
Mas nos anos 70, um cientista chamado Forrest M. Mims III descobriu que os LEDs não somente emitem luz mas também podem absorver luz e dessa forma serem usados como um fotodetector.
Características dos LEDs como fotodetectores: (Fonte: How to Use LEDs to Detect Light )
Os LEDs detectam uma faixa relativamente estreita de comprimentos de onda e portanto apresentam “seletividade espectral” sem o uso de filtros
A sensibilidade da maioria dos LEDs é muito estável ao longo do tempo
Os LEDs são mais baratos e muito mais acessíveis do que fotodiodos.
Mas nem tudo é perfeito:
LEDs não possuem a mesma sensibilidade como os fotodiodos de silício
A sensibilidade dos LEDs varia com a temperatura (Ver: How are LEDs affected by heat?). Isso pode ser um problema para o uso em ambientes com grandes variações de temperatura.
Isso pode ser compensado com o uso de um sensor de temperatura para realizar uma correção do sinal ou então o uso de medidas “diferenciais” ao invés de medidas absolutas
A medida da intensidade luminosa pode ser feita por medições de corrente, ou modo fotocorrente (Figura J.25):
Figura J.25. Medida da intensidade de luz através da medida da fotocorrente gerada. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
A fotocorrente pode ser facilmente medida com a ajuda de um amplificador operacional na configuração do um amplificador inversor (conversor I-V ou seguidor de corrente) como mostrado na Figura J.25. Ou na configuração de um amplificador não inversor dependendo da polarização do LED (direta ou invertida). Em ambos os casos a tensão de saída do amplificador é proporcional à intensidade da luz.
Figura J.26. Amplificação da fotocorrente de um LED com circuito amplificador inversor (Fonte: How to Use LEDs to Detect Light)
A intensidade luminosa também pode ser medida por tensão no modo fotovoltaico (Figura J.27):
Figura J.27. Medida da intensidade de luz através da medida da fototensão gerada. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
No modo fotovoltaico mede-se a tensão do diodo, normalmente com um amplificador operacional operando como um seguidor de tensão para evitar a drenagem de fotocorrente do LED.
A fotocorrente é proporcional à intensidade da luz, enquanto que no modo fotovoltaico obtém-se uma resposta logarítmica. Para medições quantitativas, o modo de fotocorrente é geralmente preferido, uma vez que o modo fotovoltaico tem menor precisão, causada principalmente por uma dependência significativa da temperatura. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
Uma forma alternativa para medir a intensidade de luz pode ser feita por medidas do tempo de descarga da capacitância “parasita” do LED, ou modo de descarga da junção (Figura J.28):
Figura J.28. Medida da intensidade de luz por medidas do tempo de descarga da junção. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
Nas medidas de “tempo de descarga da junção” os terminais do LED detector são ligados a dois pinos digitais de uma placa Arduino configuradas como OUTPUT e no estado LOW (0 V). Para a realização da medida o LED emissor é “desligado” e o pino digital ligado ao catodo (-) do LED passa para o estado HIGH (5 V), polarizando inversamente o LED durante um curto intervalo de tempo (~0,1 ms), e carregando a capacitância intrínseca da junção do LED. Em seguida este pino é configurado como INPUT (alta impedância) e o LED emissor é ligado.
A partir do instante em que o LED emissor é ligado é feita a contagem do tempo para o pino digital, configurado como INPUT, passar do estado HIGH (5V) para o estado LOW (0V), que corresponde ao tempo de descarregamento da capacitância parasita do LED. O tempo de descarregamento é proporcional à fotocorrente gerada que por sua vez é proporcional à intensidade luminosa incidente sobre o LED.
Figura J.29. Influência da intensidade luminosa no tempo de descarregamento da capacitância parasita do LED. (Fonte: T³: Using LEDs as light sensors (Sparkfun))
Dasgupta e colaboradores (LEDs for Analytical Chemistry, 2014) demonstram, a partir da equação de Shockley, que com alta intensidade de iluminação (I) a fototensão (VD) gerada pelo LED é proporcional ao logaritmo da intensidade de luz (ln I) segundo a equação J.1.
Equação J.1. Relação logarítmica entre a fototensão (VD) e a intensidade de luz (I) incidente sobre o LED
E com baixa intensidade luminosa a relação é linear conforme a equação J.2:
Equação J.2. Relação linear entre a fototensão (VD) gerada e a intensidade de luz (I) incidente sobre o LED
Essa é uma informação que pode ser útil para ajustar o modelo de calibração ao tipo de resposta esperada.
Nota
Os LEDs apresentam maior “sensibilidade” em comprimentos de onda próximo ou menor do que o comprimento de onda de emissão. Por exemplo, um LED verde é sensível à luz azul e a alguma luz verde, mas não a luz amarela ou vermelha.
A figura J.30 mostra a intensidade máxima e as regiões de maior sensibilidade para 5 diferentes LEDs: 3 LEDs com emissão no vervelho (R1, R2 e R01), 1 LED amarelo (Y1) e 1 LED verde (G1).
Figura J.30. O gráfico superior mostra as regiões de emissão máxima para os LEDs: R1 (630 nm), R2 (635 nm), R01 (637 nm), Y1 (595 nm) e G1 (578 nm). E o gráfico inferior mostra as regiões de maior sensibilidade para os mesmos LEDs sendo usados como fotodetectores. (Fonte: Duy Anh BUI, 2016)
O gráfico indica que os LEDs R1 e R2 (vermelho) seriam adequados como fotodetectores para o LED G1 (verde), e o LED R01 (vermelho) seria mais adequado para uso como fotodector do LED Y1 (amarelo).
No entanto isso não é uma regra pois a sensibilidade dos LEDs varia dependendo do fabricante e até mesmo para diferentes lotes de um mesmo fabricante. Ou seja, a região de sensibilidade máxima deve ser avaliada para cada LED individualmente. :-(
Alguns links sobre o uso de LEDs como fotodectores:
O procedimento experimental convencional de obtenção de espectros de absorção em um instrumento deste tipo envolve inicialmente o registro de um espectro do ruído de fundo (background) ou do solvente ou do ar (a serem utilizados como branco). Arquiva-se o mesmo e, em sequência, se obtém o espectro da amostra e se efetua a subtração dos dois. O resultado deve ser o espectro da amostra tendo-se o solvente (ou ar) como branco.
O procedimento de calibração consiste em ajustar o nível de 100% de transmitância (zero de absorbância) do equipamento com uma cubeta contendo todos os componentes da solução a ser medida, menos a substância de interesse ("branco"), e o nível 0% de transmitância com o obturador do aparelho fechado.
As leituras das amostras serão feitas em relação ao branco, substituindo-o pelas amostras.
Na configuração de duplo feixe é necessário um componente denominado obturador eletromecânico (chopper), que tem a finalidade de alternar a passagem da luz pela cela de amostra e referências.
Os sinais elétricos gerados pelos detectores são amplificados e "comparados" pelo sistema eletrônico gerando um espectro de absorbância ou transmitância da amostra "subtraído" do espectro da referência.
Para equipamentos de duplo feixe, a radiação proveniente do monocromador é igualmente dividida em dois feixes, que incidem em dois compartimentos, o de referência e o da amostra. O ajuste inicial é feito colocando-se o "branco" nos dois compartimentos e regulando-se o aparelho para absorbância zero, e as leituras são feitas substituindo-se o "branco" do compartimento da amostra pelas amostras a serem medidas. O usuário deverá ler atentamente o manual do seu equipamento para se informar sobre os demais detalhes operacionais.
Todo espectrofotômetro deve possuir um compartimento para acomodar a cubeta ou cela de leitura.
Os compartimentos podem dispor de recursos para termostatização da cubeta permitindo realizar medidas de absorção em diferentes temperaturas.
Para os métodos de análise em fluxo são usadas celas de fluxo nas quais a amostra circula continuamente através da cela com leitura simultânea da Absorbância ou Transmitância.
Figura J.35. Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho óptico.(Fonte: www.starna.com)
Figura J.36. Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico, 30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)
Com o uso de fibras ópticas é possível manter o compartimento de leitura com a cela de fluxo separada do conjunto do espectrofotômetro oferecendo maior versatilidade para o sistema de análise.
